国产精品日日摸夜夜添夜夜添无码_亚洲国产成人精品无码区99_蜜桃秘做爰免费网站_国产一区二区不卡视频_精品人人槡人妻人人玩_色777狠狠狠综合伊人_日日夜夜嫩草_国产精品无码久久久_国产精品无码久久久久av_五月天堂婷婷爱_久草资免费资源_羞羞答答综合网_又湿又紧又爽视频免费软件_每日更新日韩精品_欧美精品18videosex性欧_橙人精品在线观看

  基因傳遞的成功依賴于高效無(wú)毒的載體。病毒載體的免疫原性或致癌性大大限制了其在基因傳遞中的應(yīng)用，而非病毒載體如線性陽(yáng)離子聚合物、聚乙烯亞胺（PEI）、聚酰胺-胺（PAMAM）或聚丙烯亞胺樹(shù)狀大分子、陽(yáng)離子脂質(zhì)體和陽(yáng)離子多肽等由于其低毒性而受到研究者的青睞。這些非病毒載體可通過(guò)靜電作用與帶負(fù)電荷的基因形成結(jié)構(gòu)緊湊的、帶正電荷的復(fù)合物，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)基因的有效傳遞。

  在眾多的非病毒載體體系中，具有生物相容性骨架的含磷樹(shù)狀大分子已被應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，如抗朊病毒藥物、抗HIV藥物和人自然殺傷細(xì)胞激活劑等。基于含磷樹(shù)狀大分子的研究現(xiàn)狀，東華大學(xué)史向陽(yáng)教授團(tuán)隊(duì)和法國(guó)國(guó)家科學(xué)研究中心Jean-Pierre Majoral教授團(tuán)隊(duì)合作設(shè)計(jì)構(gòu)建了不同代數(shù)的、不同環(huán)胺封端的陽(yáng)離子型含磷樹(shù)狀大分子（Cationic Phosphorus Dendrimers, CPD），并深入系統(tǒng)地研究了其在基因傳遞及腫瘤治療方面的應(yīng)用。合作團(tuán)隊(duì)以環(huán)三聚磷腈為核，通過(guò)層層修飾的方法合成了不同代數(shù)的含磷樹(shù)狀大分子，外圍通過(guò)取代反應(yīng)修飾吡咯或哌啶環(huán)并質(zhì)子化，最終制備得到了陽(yáng)離子型含磷樹(shù)狀大分子（圖1）。

圖 1. 陽(yáng)離子型含磷樹(shù)狀大分子的合成示意圖

  首先，研究團(tuán)隊(duì)以編碼增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的質(zhì)粒（pDNA-EGFP）為報(bào)告基因，研究了CPD/pDNA-EGFP的細(xì)胞毒性及其基因傳遞效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，所有的CPD/pDNA-EGFP復(fù)合物在給定濃度范圍內(nèi)均表現(xiàn)出良好的細(xì)胞相容性。在相同條件下，表面修飾1-（2-氨基乙基）吡咯烷并質(zhì)子化的第一代含磷樹(shù)狀大分子（1-G1）對(duì)HeLa細(xì)胞的基因傳遞效率最佳（圖2）。

圖 2. CPD/pDNA復(fù)合物的（A）水合粒徑和（B）表面電勢(shì)；（C-G）不同濃度下CPD及其pDNA復(fù)合物的細(xì)胞毒性測(cè)試（以HeLa細(xì)胞為模型）；（H） CPD/pDNA-EGFP復(fù)合物基因轉(zhuǎn)染示意圖（以1-G1為例）；（I）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同N/P比條件下CPD/pDNA-EGFP復(fù)合物在HeLa細(xì)胞中EGFP（增強(qiáng)綠色熒光蛋白）的相對(duì)表達(dá)量。

  為了更進(jìn)一步的探索CPD在基因治療中的應(yīng)用，研究團(tuán)隊(duì)以篩選后得到的1-G1作為載體，轉(zhuǎn)染同時(shí)編碼EGFP和p53蛋白的質(zhì)粒（pDNA-p53），用于腫瘤細(xì)胞的基因治療。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，在優(yōu)化的條件下，HeLa細(xì)胞經(jīng)1-G1/pDNA-p53處理后，其細(xì)胞周期發(fā)生明顯改變。與此同時(shí)，實(shí)時(shí)定量PCR及蛋白質(zhì)印跡結(jié)果也表明，1-G1/pDNA-p53實(shí)驗(yàn)組中p53的mRNA和蛋白表達(dá)量有明顯升高；同時(shí)p53的下游調(diào)控基因p21及細(xì)胞周期調(diào)控因子的表達(dá)量也發(fā)生了相應(yīng)改變。因而1-G1/pDNA-p53復(fù)合物能夠在癌細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染并高效表達(dá)p53蛋白引起癌細(xì)胞凋亡（圖3）。

圖 3. PBS、1-G1、free pDNA-p53和1-G1/pDNA-p53對(duì)HeLa細(xì)胞周期及相關(guān)細(xì)胞周期因子表達(dá)的影響。（A）流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞周期分布圖；（B）流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞周期結(jié)果分析直方圖；（C）G0/G1期相關(guān)mRNA的實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果直方圖；（D）G0/G1期相關(guān)蛋白的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果；（E）蛋白質(zhì)印跡結(jié)果的分析直方圖。

  隨后，研究團(tuán)隊(duì)更深入地研究了CPD用于皮下移植瘤模型基因治療的可能性。研究發(fā)現(xiàn)，1-G1/pDNA-p53治療組中，p53、p21蛋白表達(dá)水平均高于其他各組(p < 0.001)，且細(xì)胞周期因子Cdk-4和cyclind1表達(dá)水平低于其他各組，與體外基因傳遞數(shù)據(jù)一致（圖4）。這些結(jié)果表明，制備的陽(yáng)離子型含磷樹(shù)狀大分子（1-G1）有可能作為一種高效載體系統(tǒng)用于癌癥基因治療或其它疾病的基因治療。

圖 4.（A）1-G1/pDNA-p53復(fù)合物體內(nèi)腫瘤基因治療示意圖；（B）經(jīng)生理鹽水（normal saline, NS）、1-G1、free pDNA-p53 和 1-G1/pDNA-p53治療后，皮下瘤中相關(guān)蛋白的免疫印跡結(jié)果；（C）蛋白質(zhì)印跡結(jié)果的分析直方圖。

  以上研究以“Revisiting Cationic Phosphorus Dendrimers as a Nonviral Vector for Optimized Gene Delivery Towards Cancer Therapy Applications”為題，發(fā)表在美國(guó)化學(xué)會(huì)期刊Biomacromolecules (DOI: 10.1021/acs.biomac.0c00458)上。東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院博士研究生陳亮和李錦為共同第一作者，東華大學(xué)史向陽(yáng)教授、法國(guó)國(guó)家科學(xué)研究中心Jean-Pierre Majoral教授和巴黎第五大學(xué)Serge Mignani教授為共同通訊作者。該工作得到了國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金委、上海市科委和中法蔡元培等項(xiàng)目的資助。

  論文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.biomac.0c00458