單細胞免疫印跡技術（scWestern），采用可擴展開放式的微孔陣列凝膠芯片，通過重力作用驅(qū)動細胞沉降落孔，經(jīng)化學裂解細胞并整合SDS-PAGE電泳分離細胞裂解釋放的蛋白質(zhì)，后以短時間紫外線激發(fā)（～60s）激活光敏性凝膠，凝膠與蛋白質(zhì)交聯(lián)而固定蛋白質(zhì)固定于凝膠內(nèi)。紫外交聯(lián)替代了傳統(tǒng)western blot中繁瑣的轉(zhuǎn)膜流程，實現(xiàn)在4h內(nèi)完成單細胞內(nèi)多種蛋白的表達水平分析。scWestern結(jié)合了SDS-PAGE的分子篩效應，通過蛋白質(zhì)的分子量和抗原抗體識別雙重驗證，保證了檢測的特異性，可檢測細胞表面蛋白、跨膜蛋白、胞內(nèi)及核內(nèi)的蛋白，可區(qū)分經(jīng)表觀遺傳修飾蛋白。單細胞免疫印跡技術可實現(xiàn)高通量、多指標共檢，并在單細胞水平研究復雜細胞群體，在藥物篩選、細胞異質(zhì)性研究等方面具有重要的應用價值。
單細胞免疫印跡技術的核心—光敏感性蛋白質(zhì)固定凝膠為基于二苯甲酮修飾聚丙烯酰胺凝膠BPMAC。BPMAC經(jīng)紫外激活生成的中間體半衰期較短，且可非特異性與鄰近X?H鍵（X = C, N, O, or S）反應，故而光敏固定效率較低。凝膠內(nèi)背景噪音增加，背景熒光高，方法靈敏度低，難以應用于低豐度蛋白質(zhì)的檢測。另外，紫外激發(fā)波長較短（UVB，280~320nm），可能引起蛋白抗原位點失活，造成假陰性。
近日，上海交通大學丁顯廷教授團隊在Advanced Functional Material上發(fā)表了題為“A Photoclick Hydrogel for Enhanced Single-cell Immunoblotting”的文章。該文章報道了四唑修飾的新型光敏感性丙烯酰胺凝膠。該四唑交聯(lián)丙烯酰胺凝膠將光敏基團與聚丙烯酰胺基團結(jié)合，將蛋白質(zhì)分離功能和蛋白質(zhì)光敏固定功能集合，具備以下技術優(yōu)勢：1）紫外激發(fā)波譜更窄且波長更長，能量更低。避免引起蛋白抗原位點失活及膠內(nèi)高自發(fā)熒光背景。2）與蛋白分子的功能團聚合速度更快，極大提高蛋白固定效率，避免因聚合速度慢，蛋白擴散引起的靈敏度降低。3）不影響SDS-PAGE本身的分子篩效應，保留原方法的特異性及分離分辨率。4）不影響抗原抗體結(jié)合或受體配體結(jié)合或酶活性或適配體結(jié)合等。不影響后續(xù)檢測體系的搭建。5）非選擇性？赏瑫r非選擇性固定所有蛋白質(zhì)，與蛋白質(zhì)ProtCOO-反應。該凝膠的優(yōu)良性能使其在毛細管、微流控芯片原位免疫印跡分析中具有廣闊的應用前景，為應用單細胞免疫印跡分析技術研究低豐度蛋白的研究人員提供解決方案。
上海交通大學生物醫(yī)學工程學院個性化醫(yī)學研究院是中國最早建立起單細胞免疫印跡技術的單位之一，并已初步實現(xiàn)技術向臨床應用的轉(zhuǎn)化，先后利用單細胞痕量蛋白分析技術完成了芯片CTC富集表征、有效轉(zhuǎn)染的單細胞篩選及生物通路研究方面的相關應用研究。
本研究由上海交通大學生物醫(yī)學工程學院丁顯廷和謝海洋課題組完成。博士生張婷、李山鶴是該論文的第一作者。丁顯廷教授和謝海洋助理研究員是論文的通訊作者。相關研究得到國際人類表型組計劃、科技部國家重點研發(fā)計劃、國家自然科學基金、上海市教委科研項目等項目的支持。
論文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adfm.201910739
